Scientific Reports 13권, 기사 번호: 12856(2023) 이 기사 인용
측정항목 세부정보
XCI(X염색체 불활성화) 분석은 X-연관 형질 진단에 도움이 되는 경우가 많지만, 현재 방법으로는 정확한 평가가 여전히 어렵습니다. 우리는 인간 안드로겐 수용체 유전자(AR)와 인간 X-연관 망막색소변성사 2 유전자(RP2)에서 XCI를 조사하고 엄격하게 정량화하기 위해 무증폭 Cas9 농축과 XCI-ONT라고 불리는 옥스퍼드 나노기공 기술 시퀀싱을 사용하는 새로운 전략을 개발했습니다. XCI-ONT는 AR에서 116개 CpG, RP2에서 58개 CpG에 대한 메틸화를 측정하고 PCR 편향 없이 부모 X 염색체를 분리합니다. 우리는 유전자당 하나 또는 두 개의 CpG만 조사하는 PCR 기반 황금 표준 XCI 기술에 비해 XCI-ONT 전략의 유용성을 보여줍니다. 결과는 XCI 패턴이 부분적으로 왜곡된 경우 황금 표준 기술을 사용하는 것의 한계와 XCI를 엄격하게 정량화하는 XCI-ONT의 장점을 강조합니다. 이 연구는 DNA에 대한 보편적인 XCI 방법을 제공하며, 이는 X-연관 특성의 임상 및 연구 프레임워크에서 매우 가치가 있습니다.
X염색체 불활성화(XCI)는 남성(46XY), 여성(46XX) 및 X 이수성을 가진 개인 간의 X 염색체 수 차이에 대한 보상 메커니즘입니다1. 인간 분자 XCI 메커니즘은 완전히 이해되지 않았지만2,3 연구에 따르면 XCI는 X-비활성 특정 전사체(XIST)의 유전자 발현을 포함하여 X-비활성화 센터(Xic)의 시스-작용 및 트랜스-작용 인자에 의해 제어되는 것으로 나타났습니다. 및 X-활성 특정 전사체(XACT) 유전자3. 이는 결국 단일 대립유전자 발현, H3K27me33의 축적 및 비활성 X 염색체(Xi)의 유전자 프로모터 근처 CpG 부위의 메틸화로 이어집니다(그림 1A)4,5,6. 메틸화는 Xi의 비활성 상태를 유지하는 데 중요한 것으로 나타났습니다7,8,9,10. 인간의 XCI는 초기 배아 이식 단계3에서 시작되며, 비활성화할 X 염색체의 선택은 일반적으로 두 X 염색체가 동일하게 나타나는 무작위 과정으로 설명됩니다11,12. 그러나 편향된 XCI라고 불리는 하나의 X 염색체의 우선적 불활성화는 보균자 여성에서 X 연관 질병 징후를 수정하는 것으로 관찰되었으며, 이는 활성 X 염색체(Xa)의 선택에 유전자형이 중요하다는 것을 나타냅니다. 돌연변이 세포 단점으로 인한 세포 선택. 첫째, 병원성 대립유전자의 우선적 침묵은 선택적 여성 생존 또는 X-연관 특성의 덜 심각한 영향과 연관되어 있습니다. 극단적인 편향은 보인자 여성15,17,18에서 병원성 X 연결 변이의 존재에 대한 좋은 지표로 나타났으며 가족 친척의 XCI 분석은 종종 X 연결 변이의 해석에 도움이 됩니다. 둘째, 병원성 대립유전자의 발현은 X-연관 특성의 보인자 암컷에서 표현형의 발현으로 이어질 수 있으며19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 영향을 받은 보인자 암컷에서 관찰되는 표현형 차이를 설명할 수 있습니다. X-이수성을 가진 개인21,24,29,30,31,32,33,34,35,36. 참고로, XCI 분석은 다양한 연령층과 비흡연자37,38,39,40,41,42,43,44에서 관련 조직에서 수행하는 것이 좋습니다. 일반적으로 왜곡의 정의는 > 80:20이지만 XCI 분석에 사용되는 황금 표준 기술의 한계로 인해 100:0 침묵 이외의 경우 왜곡의 정량화는 권장되지 않으며 정량적 방법의 필요성이 강조됩니다. .
(A) X-염색체 불활성화 메커니즘과 X-연관 특성의 보인자 여성에 미치는 영향의 개략도. 파란색: 활성 X 염색체(Xa), 빨간색: 비활성 X 염색체(Xi), 노란색 별: 병원성 X 연결 변종. Adobe Illustrator 2022를 사용하여 만든 일러스트레이션(https://adobe.com/products/illustrator에서 사용 가능) (B) 황금 표준 XCI 방법은 Xa를 절단하지만 Xi는 그대로 유지하는 메틸화 민감성 제한 효소(HpaII)를 사용합니다. HpaII는 안드로겐 수용체(AR)와 망막색소변성사 2(RP2)에서 각각 2개와 1개의 CpG 부위를 표적으로 삼고, 이어서 모 대립유전자를 분리하는 다형성 반복 영역(CAGn 또는 GAAAn)에 걸친 PCR 및 단편 길이 분석(FLA)이 이어집니다. Adobe Illustrator 2022(https://adobe.com/products/illustrator에서 사용 가능)를 사용하여 만든 일러스트레이션. XCI-ONT 접근법은 AR의 116개 CpG 사이트와 RP2의 58개 CpG 사이트에 걸쳐 ~ 3kb 관심 영역(ROI) 측면에 있는 3개의 gRNA(분홍색)가 있는 CRISPR-Cas9 농축을 사용하여 메틸화 상태와 관계없이 DNA를 절단합니다. (C) XCI-ONT는 다음을 포함합니다: (1) 표적외 가닥에 대한 서열분석 어댑터의 결찰을 감소시키기 위한 5' 말단의 탈인산화. (2) CRISPR-Cas9 시스템은 ROI를 결합하고 절단하며, DNA는 3' dA 꼬리와 5' 인산화된 Cas9 절단면에 대한 어댑터 결찰을 위해 dA 꼬리입니다. (3) 라이브러리는 Oxford Nanopore Technologies 및 Bonito 염기 호출을 사용하여 서열 분석됩니다. (4) 해당 영역에서 가능한 모든 반복이 포함된 참조 게놈에 읽기를 정렬하여 반복을 호출하고, 다른 반복으로 읽기 수를 표시하여 읽기를 일배체형으로 나눕니다. 마지막으로 Nanopolish를 사용하여 메틸화 호출 및 정량화를 수행하고 IGV(Integrative Genomics Viewer)를 사용하여 데이터를 시각화합니다. ROI의 평균 메틸화가 계산되고 두 X 염색체 사이의 XCI 비율이 결정됩니다.
80:20), often used in the interpretation of X-linked variants. In addition, quantification can be very useful when XCI is modifying disease e.g. in the investigation of carrier females presenting symptoms due to expression of the pathogenic allele (incomplete silencing). Approaches for quantifying the levels of XCI on the maternal and paternal allele have been proposed before but this requires either bisulfite conversion and PCR50 or paired RNA and DNA sequencing data of the XIST gene using informative transcribed heterozygous single nucleotide variants (SNVs) to separate the parental alleles41,51. A SNV is not as informative as repeated elements and can therefore not be used to distinguish between individuals. This highlights the need for a universal quantitative XCI analysis on DNA to be used for research applications and clinical diagnostics related to X-linked traits./p> T;p.(Arg1190Cys), NM_004606.4) where carrier females had ~ 100:0 skewed XCI when investigating the AR gene57. The XCI result was confirmed in this study by investigating the RP2 locus of two asymptomatic carrier females (IV:8, III:10) and one asymptomatic non-carrier female (III:7) (Supplementary Fig. 1). The two asymptomatic carrier females presented a ~ 100:0 skewed XCI status consistent with the maternal X-chromosome being silent (carrying the pathogenic variant). The asymptomatic non-carrier female had expression of both alleles i.e. a random XCI status, however the method presents variable result between experiments and contrasting results in the different genes (63:37 in AR vs. 47:53 in RP2). In addition, three females (female I, II and III) were investigated using the golden standard method. All individuals showed different ratios of XCI for both AR (female I 62:38, female II 47:53 and female III 81:19) and RP2 (female I 81:19, female II 60:40 and female III 87:13) (Table 1, Supplementary Fig. 2)./p> 80:20), often assisting in the interpretation of X-linked variants. In addition, quantification can be highly useful in the investigation of carrier females manifesting symptoms due to expression of the pathogenic allele. Quantification of XCI can illuminate the mechanism of disease, and provide useful information for improving prenatal risk assessment36, diagnostics and treatment development of X-linked traits. Lastly, we would like to illuminate the possibility that different disorders and pathogenic variants requires different levels of expression to develop symptoms and stress the use of a quantitative XCI investigation to answer these questions. A related application for XCI-ONT is monitoring pharmacological Xi reactivation, which has been suggested as treatment for X-linked disorders due to skewed XCI59,60,61,62./p> T;p.(Arg1190Cys) variant in the TAF1 gene (NM_004606.4)57. DNA from two carrier females (III:10, IV:8) and one non-carrier female (III:7) as well as three unrelated females (female I-III) was included in the current analysis./p> 20). The data were visualized by plotting the number of reads (y-axis) containing any repeat in the range of 5–40 repeats in AR or 5–30 repeats in RP2 (x-axis) (Supplementary Fig. 3). The reads were divided into haplotypes based on the repeat count and comparison with the golden standard results. Methylation calling and calculation of the methylation frequency was performed using Nanopolish software package (version 0.12.0). Only sites with a log-likelihood ratio > 2.5 (methylated) or < − 2.5 (unmethylated) were included in the methylation analysis (Supplementary Fig. 5). Bam-files were converted using the “converting bam for igv” package66 and the methylation status was visualized using Integrative Genomics Viewer bisulfite mode CG (version 2.10.0). The XCI status was established by using the average methylation frequency in the chrX:67543761–67546170 region (AR gene, 116 CpG sites, hg38) and chrX:46836539–46837273 region (RP2 gene, 58 CpG sites, hg38) followed by calculating the ratio of the average methylation between the alleles in each gene./p>
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